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Tout savoir sur le microbouturage
La micropropagation a profondément modifié la production de plants pour de nombreuses espèces à multiplication végétative.
Le taux de multiplication obtenu par la culture de tissus est bien supérieur à celui de la multiplication traditionnelle.
En effet, lors du bouturage, le nombre de boutures que l’on peut prélever sur chaque pied-mère est limité, ce qui limite également le nombre de greffons que le pied-mère peut donner.
Dans le cas de la culture in vitro, la nature du matériel végétal utilisé comme explant est différente. Toute partie de la plante, allant d’un fragment microscopique à une microbouture bien formée, peut régénérer une plante entière.
Cela permet une économie de plantes, car elle permet de stocker une grande quantité de microplants sur un espace réduit. Une étagère de culture mesurant 60 x 120 (L) x 180 (H) cm peut contenir environ 400/500 microplants. La culture in vitro permet ainsi de libérer de grandes surfaces de serre.
La culture in vitro permet également une économie de temps : la durée nécessaire pour la multiplication d’un nouveau génotype issu de la création est ramenée de plusieurs années à quelques mois.
L’asepsie en culture in vitro
L’asepsie est un facteur crucial pour le succès d’une culture. Les explants de petite taille mis en culture ne peuvent pas résister à l’action délétère des champignons ou des bactéries présents dans le milieu de culture.
Ces micro-organismes se développent très rapidement, favorisés par un environnement propice à leur multiplication.
Ils peuvent envahir tout le milieu en quelques jours, submergeant l’explant dans les filaments de mycéliums ou des amas bactériens, entraînant sa nécrose et sa mort.
L’infection peut provenir de diverses sources, notamment :
- Du matériel végétal mis en culture
- Du corps humain, qui manipule et transporte de nombreux microorganismes via la peau, les vêtements et la respiration.
- Des instruments de travail
- De l’atmosphère ambiante, qui contient des spores de bactéries et champignons en suspension
Pour chaque manipulation, l’élimination des germes pathogènes est assurée par divers moyens tels que les agents chimiques, la chaleur (autoclave), les rayons ultraviolets, la flamme du bec Bunsen et le système de filtration de l’air.
Stérilisation des matériels végétaux
L’acquisition aseptique des tissus végétaux représente le moment le plus sensible de la technique in vitro.
Les tissus végétaux sont couverts de spores, de champignons ou de bactéries. Habituellement, les tissus obtenus à partir d’organes en contact avec le sol sont davantage contaminés. Il est primordial de se débarrasser de ces sources d’infection, car elles peuvent compromettre le succès de la culture.
Les explants de vanille sont stérilisés car ils proviennent de plantes dans des conditions naturelles. Pour contourner les problèmes de stérilisation de certains matériaux végétaux, il est possible de travailler sur des plantes déjà cultivées en tubes. On appelle cette méthode la “méthode antiseptique”.
Les explants de vanille, qui comprennent des morceaux de feuilles, d’entre-nœuds, de racines et de nœuds, sont stérilisés de la manière suivante :
Initialement, les feuilles et les racines aériennes sont retirées des tiges. Seuls les organes en parfaite santé, sans aucune lésion ou attaque parasitaire, sont conservés.
Par la suite, les organes (feuilles, racines, tiges) sont lavés abondamment et brossés avec soin pour prévenir toute blessure. Cette étape vise à éliminer les particules de terre qui recouvrent les organes et à dissimuler les contaminants.
Les tiges sont alors découpées en 2 ou 4 morceaux en fonction de leur taille. Ces sections d’organes sont placées dans un récipient à ouverture étroite et fermé. Elles sont immergées dans de l’alcool à 90%, ce qui permet de dissoudre l’enrobage cireux qui recouvre généralement les organes.
Une autre méthode peut également être employée, qui consiste à immerger les tiges dans de l’alcool isopropylique à 70% pendant 5 minutes tout en effectuant des mouvements rotatifs du contenant.
Enfin, une seconde désinfection est réalisée avec une solution d’hypochlorite de calcium à une concentration de 2,5% pendant 5 minutes.
Suite à la stérilisation, on élimine les produits chimiques en rinçant 3 ou 4 fois les fragments d’organe avec de l’eau stérile. Cette procédure est essentielle pour empêcher l’impact ultérieur de ces produits sur la culture.
Le rinçage doit se dérouler dans un environnement stérile, à proximité de la flamme d’un bec Bunsen ou sous une hotte à flux laminaire, pour minimiser le risque de contamination par l’air ambiant.
Stérilisation des matériels et milieux de culture
L’application de la chaleur, qu’elle soit sèche ou humide, est une pratique couramment utilisée pour stériliser les milieux nutritifs et les équipements. La stérilisation peut également être effectuée à l’aide de produits tels que l’alcool ou l’eau de Javel pour les équipements.
Stérilisation des équipements
Les pinces et les scalpels (s’ils ne sont pas à usage unique et déjà stérilisés) sont immergés dans de l’alcool ou une solution de javel. Cette procédure doit être effectuée à chaque changement d’explant pour prévenir la transmission de germes d’un explant à un autre.
Stérilisation des milieux de culture
Les milieux nutritifs peuvent être répartis dans une variété de contenants, y compris des boîtes de Pétri, des erlenmeyers, des tubes à essai, des microbox, des tupperwares et d’autres types de récipients…
Ces récipients abritent un milieu de culture, et un tampon de coton hydrophile est positionné sur l’ouverture. L’ensemble est par la suite enveloppé dans un papier Kraft résistant, maintenu par une ficelle, puis placé dans un autoclave.
Les cotons humides favoriseront ultérieurement la germination des spores de champignons et la multiplication des bactéries qui s’y déposent.
Il est connu que la stérilisation à l’autoclave à une température avoisinant les 120°C entraîne certaines modifications chimiques des composants du milieu.
En cas d’absence d’autoclave vous pouvez procédez autrement
Positionnez les récipients dans le compartiment vapeur de l’autocuiseur, après avoir préalablement versé environ 1 cm d’eau au fond voir plus en fonction de l’autocuiseur.
Scellez l’autocuiseur et placez-le sur une source de chaleur intense. Lorsque l’autocuiseur commence à émettre un sifflement, modérez la source de chaleur pour que la soupape produise un sifflement léger et démarrez alors un compte à rebours de 24 minutes de “cuisson”.
Une fois ce délai écoulé, interrompez la source de chaleur (ou retirez l’autocuiseur de la plaque si votre cuisinière est électrique) et laissez la pression diminuer et l’autocuiseur refroidir complètement avant de l’ouvrir. Extrayez-les de l’autocuiseur.
En refroidissant, le milieu gélosé se solidifie. Recouvrez-les d’un film plastique pour empêcher l’infiltration d’air. Ils peuvent présenter une déformation en sortant de l’autocuiseur, mais ils retrouveront leur forme initiale après refroidissement. Après deux heures, stockez vos contenants à température ambiante, à l’abri des chocs (buffet, étagère, etc.) Vous pouvez également les conserver au réfrigérateur si vous ne prévoyez pas de les utiliser avant plusieurs semaines.
Au bout de trois ou quatre jours, effectuez une vérification pour détecter d’éventuelles contaminations. Éliminez tous ceux qui vous semblent suspects (dépôt blanchâtre, mousse, etc.…)
La stérilisation des Microbox s’effectuera avec une mèche positionnée dans un coin, tandis que le couvercle sera fermé aux trois autres coins. Disposez les boîtes et initiez la source de chaleur de manière à ce que la pression augmente progressivement.
Après 25 minutes de cuisson, laissez la pression diminuer et ouvrez votre autocuiseur.
Retirez les bandes et fermez le dernier coin.
(Pour plus d’information consulté le site https://kayorchid.com
Stérilisation de la chambre d’ensemencement ou de la hotte à flux laminaire
L’air contient en suspension des microorganisme qui peuvent contaminer le milieu de culture. L’ensemencement doit être réalisé dans une “chambre stérile”. C’est un local de petit dimension, à parois en vitres , plastique muni d’une paillasse. Cela peut être une hotte à flux laminaire ou bien un box réalisé soit même si on a pas les moyen d’avoir une hotte. ( exemple de la glove box )
Pour la hotte à flux laminaire, la stérilisation est réalisée par des rayons ultraviolets qui éliminent une partie des spores en suspension. Les ultraviolets sont émis pendant environ 12 heures avant l’ensemencement et doivent être arrêtés pendant la mise en culture.
Un système de filtration de l’air est activé avant et pendant la manipulation. On utilise des filtres à particules qui bloquent les particules supérieures à 0,22 micron. La filtration est assurée par un ventilateur extracteur qui maintient une ventilation constante, de faible vitesse à travers le filtre et qui a la particularité de produire un flux d’air stérile laminaire.
En complément du système de filtration, il est nécessaire d’effectuer un nettoyage de la paillasse à l’aide d’alcool à 90%.
Milieux de culture
Choix du milieu de culture
Une plante entière puise dans le sol les éléments qui participent à l’élaboration de ses tissus et contribuent à ses activités physiologiques. Elle a aussi la capacité de synthétiser certaines substances intervenant dans des réactions spécifiques à son organisme végétal.
En milieu artificiel on essaie de créer un milieu dont la composition offre à l’explant la possibilité de croitre et de se développer comme une plante entière.
Le choix d’un milieu de culture est difficiles car chaque espèce a son exigence propre vis-à-vis du milieu nutritif. Il faut pratiquer plusieurs essais pour trouver la solution nutritive adéquate.
La stérilisation du milieu a été réalisée par autoclavage à 121˚C pendant 25 min. Le pH a été ajusté à 5,7 – 5,8
Voici quelque milieu qui peuvent être utilisé :
- K400 + poudre de coco, KOFF +
- Le milieu de Murashige et Skoog
- Le milieu de Murashige et Skoog , complété par 30 g l -1 de saccharose.
- Le milieu de Murashige et Skoog complétés par 100 mgL-1 de myoinositol, 150 mgL-1 d’acide citrique, 100 mgL-1 d’acide ascorbique, 20 gL-1 de saccharose et 5 gL-1 d’agar-agar.
- 1 mg/L BAP et milieu MS à moitié concentré
Pour le repiquage on peut utilisé comme milieu :
- Le milieu de Murashige et Skoog à moitié concentré additionné de 0,44 μm de NAA, 100 mgL-1 de myoinositol, 20 gL-1 de saccharose et 5 gL-1 d’agar-agar.
- Le milieu de Murashige et Skoog
complété soit par IBA (0,5 et 1,0 mg/L), soit par NAA (0,5 et 1,0 mg/L)
Préparation de la solution de culture
Le pesage de chaque composant d’un milieu de culture nécessite une grande précision et prend donc beaucoup de temps.
Une fois la solution nutritive préparée, son pH doit être ajusté entre 5,5 et 6. La solution doit être limpide, avec une dissolution complète de la gélose et des cristaux de sucre.
On procède ensuite à la répartition de la solution dans les récipients de culture choisis. Cette opération est assez délicate car elle implique de répartir manuellement la solution de culture à haute température dans les différents récipients.
Cette manipulation doit être effectuée rapidement pour éviter que la solution ne gélifie dans la casserole ou le ballon. Il est nécessaire d’agiter constamment le mélange pour obtenir une solution homogène dans tous les récipients. Enfin, on referme les récipients avec du coton ou un couvercle pour les boîtes spéciales de micropropagation.
Mise en culture des explants de vanille
Pour commencer, il est essentiel de procéder à une hygiène rigoureuse, en se lavant les mains et les avant-bras, ainsi que la paillasse, à l’aide d’alcool. Les instruments sont ensuite nettoyés et, si nécessaire, passés à la flamme avant d’être laissés à refroidir.
Les organes stérilisés de vanille sont transférés dans un récipient. Les tissus blanchis par les agents stérilisants ainsi que les parties de l’organe endommagées sont retirés à l’aide d’un scalpel. Seules les parties vivantes, non nécrosées sont conservées pour la culture, car les cellules mortes peuvent réduire ou annuler les échanges entre l’explant et le milieu de culture.
Les fragments de tiges sont découpés en tranches de 1 cm de longueur. Le transport de l’explant dans le tube de culture nécessite beaucoup de soin et d’habileté pour éviter l’introduction de germes de micro-organismes dans le milieu.
La pratique de l’ensemencement s’effectue comme suit :
Le tube de culture doit être incliné pour éviter la chute de poussière dans le milieu. On saisit à l’aide d’une pince à branches souples un fragment et on le plante verticalement dans la gélose de manière qu’il soit enfoncé de quelques millimètres dans le substrat. Enfin, on referme le récipient.
Installation en chambre de culture
Les boîtes contenant nos microboutures sont ensuite installées dans une pièce maintenue à une température de 25°C ± 1. L’éclairage est assuré par une photopériode de 16 heures grâce à l’utilisation de lampes fluorescentes émettant une lumière blanche froide, avec une intensité lumineuse variant entre 1000 et 2000 lux.
Acclimatation en milieu naturel
Les plantules sont délicatement retirées des récipients, qui ne contiennent plus qu’un ou deux spécimens chacun. Elles sont ensuite transplantées dans des pots contenant un compost spécifique. Ce compost peut être composé des éléments suivant : coïr de coco haché, sphaigne, laine de roche, perlite , écorce de pins. L’ensemble est soigneusement mélangé et stérilisé à la chaleur humide pendant deux heures à température d’ébullition.
Les pots sont ensuite placés dans des serres ombragées mais non chauffées. Les variations de température y sont atténuées (facteur de possible pourriture de la liane) , et surtout, les plants sont protégés des fortes pluies, du vent et des prédateurs. Les plants sont régulièrement arrosés, tuteurés, bouclés, et les surfaces des pots sont périodiquement nettoyées. Après une à deux années, les plants sont transplantés en pleine terre.
