Contents
- 1 Comprendre la culture de graines in vitro
- 1.1 Développement des graines de vanille en milieu naturel
- 1.2 Développement des graines de vanille en laboratoire
- 1.3 L’asepsie en culture in vitro
- 1.4 Stérilisation du matériel végétal
- 1.5 Stérilisation du matériel et des milieux de culture
- 1.6 Milieux de culture
- 1.7 Mise en culture des graines de vanille
- 1.8 Mise en culture des protocormes de vanille
- 1.9 Installation en chambre de culture
- 1.10 Acclimatation en milieu naturel
Comprendre la culture de graines in vitro
La culture in vitro de graines est une technique de propagation végétale en laboratoire qui permet une production à grande échelle et contrôlée de plantes.
Elle implique la germination des graines de vanille dans un environnement stérile et régulé, en utilisant des nutriments spécifiques et des hormones de croissance pour stimuler leur développement. Les graines sont d’abord stérilisées pour éliminer toute bactérie ou champignon potentiellement nuisible à leur croissance. Par la suite, elles sont placées dans un milieu de culture spécifique où elles germent et se développent en plantules.
La culture in vitro de graines est une méthode efficace pour produire des plants de vanille sains et homogènes. Cependant, elle nécessite un équipement spécialisé et une expertise technique. De plus, elle permet un brassage génétique et offre la possibilité de créer des hybrides par le croisement de différentes plantes. La création d’hybrides vise à améliorer les caractéristiques des plantes, telles que leur rendement, leur résistance aux maladies, aux ravageurs et à la sécheresse. Il est crucial de maintenir un brassage génétique pour éviter l’homogénéité excessive des plants de vanille, ce qui pourrait faciliter la transmission de maladies entre les plantes.
Développement des graines de vanille en milieu naturel
Les graines produites par la vanille présentent une germination exceptionnellement faible. Elles possèdent un embryon indifférencié, peu de matière de réserve, des téguments très durs et cireux contenant des inhibiteurs de germination (Kleinert, 1963, cité dans : (Dequaire 1976)).
Childers et al. (1959) ont observé qu’un nombre minime de graines pouvaient germer (à peine 1 à 2 %) dans des conditions idéales d’humidité, de température et de nutrition. À la station expérimentale fédérale de Mayaguez à Porto Rico, ils ont constaté que des graines pouvaient germer et pousser sur un support en bois pourri et humide. La dépendance des graines d’orchidées aux champignons mycorhiziens pour la germination est largement reconnue (Arditti et Ghani 2000).
Malgré une longue période de dormance due à la taille extrêmement petite des graines, à l’embryon indifférencié et au manque d’endosperme, la vanille est soupçonnée d’être hautement hétérozygote avec d’importantes variations génétiques en raison de sa pollinisation croisée dans la nature.
Les progénitures de semis de vanille sont considérées comme une source riche de variabilité pour la sélection et l’amélioration des cultures (Minoo et al., 1997).
La propagation végétative demeure le mode de reproduction prédominant chez la vanille. Elle se produit naturellement à partir de boutures de tige (Bouriquet 1954). Dans des conditions naturelles, un individu de V. planifolia peut couvrir de très grandes surfaces, jusqu’à 0,2 ha, bien que pas très densément (Soto Arenas 1999b).
Développement des graines de vanille en laboratoire
L’asepsie en culture in vitro
L’asepsie est un élément déterminant pour la réussite d’une culture. Les explants de petite taille mis en culture ne peuvent pas résister à l’action néfaste des champignons ou des bactéries présents dans le milieu de culture.
Ces micro-organismes se développent très rapidement, favorisés par un environnement propice à leur multiplication.
Ils peuvent envahir tout le milieu en quelques jours, submergeant l’explant dans les filaments de mycéliums ou des amas bactériens, entraînant sa nécrose et sa mort.
L’infection peut provenir de diverses sources, notamment :
- Du matériel végétal mis en culture
- Du corps humain, qui manipule et transporte de nombreux microorganismes via la peau, les vêtements et la respiration.
- Des instruments de travail
- De l’atmosphère ambiante, qui contient des spores de bactéries et champignons en suspension
Pour chaque manipulation, l’élimination des germes pathogènes est assurée par divers moyens tels que les agents chimiques, la chaleur (autoclave), les rayons ultraviolets, la flamme du bec Bunsen et le système de filtration de l’air.
Stérilisation du matériel végétal
Dans la culture de la vanille, une méthode aseptique a permis d’assurer une germination des graines de l’ordre de 70 à 80%. Cette technique a été largement exploitée pour l’élaboration de variétés résistantes à la pourriture des racines, notamment causée par le Fusarium (Knudson, 1950; Withner, 1955).
L’acquisition aseptique des tissus végétaux constitue l’étape la plus délicate de la technique in vitro.
Des gousses vertes de sept mois sont prélevées pour éviter qu’elles ne commencent à se fendre et augmentent ainsi les risques de contamination des graines, ce qui compliquerait grandement la désinfection. Les gousses vertes de 5 à 7 mois de maturité constituent l’explant idéal pour la culture in vitro. Les gousses mettent 10 à 12 mois pour atteindre leur pleine maturité.
Une fois collectées, elles sont immédiatement désinfectées dans une solution d’eau oxygénée à 50% ou d’alcool isopropylique à 70%. Ce traitement de pré-stérilisation est suivi d’une stérilisation complète dans l’armoire à flux laminaire.
Par la suite, les graines sont extraites de la gousse, dissociées et environ 300 d’entre elles sont réparties dans des boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre.
Stérilisation du matériel et des milieux de culture
L’utilisation de la chaleur, qu’elle soit sèche ou humide, est une méthode fréquemment employée pour stériliser les milieux nutritifs et les équipements. La stérilisation peut également être réalisée à l’aide de substances telles que l’alcool ou l’eau de Javel pour les équipements. Il est essentiel de noter que ces procédures doivent être effectuées avec soin pour garantir l’élimination efficace des micro-organismes potentiellement nuisibles tout en préservant l’intégrité des milieux nutritifs et des équipements.
Stérilisation des équipements
Les pinces et les scalpels (s’ils ne sont pas à usage unique et déjà stérilisés) sont immergés dans de l’alcool ou une solution de javel. Cette procédure est essentielle à chaque changement d’explant afin de prévenir la transmission de germes d’un explant à un autre. Il est crucial de maintenir des conditions stériles pour assurer le succès de la culture in vitro.
Stérilisation des milieux de culture
Les milieux nutritifs peuvent être distribués dans une variété de récipients, y compris des boîtes de Pétri, des erlenmeyers, des tubes à essai, des microbox, des tupperwares et d’autres types de contenants…
Ces récipients hébergent un milieu de culture, et un tampon de coton hydrophile est positionné sur l’ouverture. L’ensemble est ensuite enveloppé dans un papier Kraft résistant, maintenu par une ficelle, puis placé dans un autoclave.
Les cotons humides favoriseront ultérieurement la germination des spores de champignons et la multiplication des bactéries qui s’y déposent.
Il est connu que la stérilisation à l’autoclave à une température avoisinant les 120°C entraîne certaines modifications chimiques des composants du milieu.
Positionnez les récipients dans le compartiment vapeur de l’autocuiseur, après avoir préalablement versé environ 1 cm d’eau au fond voir plus en fonction de l’autocuiseur..
Scellez l’autocuiseur et placez-le sur une source de chaleur intense. Lorsque l’autocuiseur commence à émettre un sifflement, modérez la source de chaleur pour que la soupape produise un sifflement léger et démarrez alors un compte à rebours de 24 minutes de “cuisson”.
Une fois ce délai écoulé, interrompez la source de chaleur (ou retirez l’autocuiseur de la plaque si votre cuisinière est électrique) et laissez la pression diminuer et l’autocuiseur refroidir complètement avant de l’ouvrir. Extrayez-les de l’autocuiseur.
En refroidissant, le milieu gélosé se solidifie. Recouvrez-les d’un film plastique pour empêcher l’infiltration d’air. Ils peuvent présenter une déformation en sortant de l’autocuiseur, mais ils retrouveront leur forme initiale après refroidissement. Après deux heures, stockez vos contenants à température ambiante, à l’abri des chocs (buffet, étagère, etc.) Vous pouvez également les conserver au réfrigérateur si vous ne prévoyez pas de les utiliser avant plusieurs semaines.
Au bout de trois ou quatre jours, effectuez une vérification pour détecter d’éventuelles contaminations. Éliminez tous ceux qui vous semblent suspects (dépôt blanchâtre, mousse, etc…)
La stérilisation des Microbox s’effectuera avec une mèche positionnée dans un coin, tandis que le couvercle sera fermé aux trois autres coins. Disposez les boîtes et initiez la source de chaleur de manière à ce que la pression augmente progressivement.
Après 25 minutes de cuisson, laissez la pression diminuer et ouvrez votre autocuiseur.
Retirez les bandes et fermez le dernier coin.
(Pour plus d’information consultez le site https://kayorchid.com )
Stérilisation de la chambre d’ensemencement ou de la hotte à flux laminaire
L’air contient en suspension des microorganisme qui peuvent contaminer le milieu de culture. L’ensemencement doit être réalisé dans une « chambre stérile ». C’est un local de petit dimension, à parois en vitres , plastique muni d’une paillasse. Cela peut être une hotte à flux laminaire ou bien un box réalisé soit même si on a pas les moyen d’avoir une hotte. ( exemple de la glove box )
Pour la hotte à flux laminaire, la stérilisation est réalisée par des rayons ultraviolets qui éliminent une partie des spores en suspension. Les ultraviolets sont émis pendant environ 12 heures avant l’ensemencement et doivent être arrêtés pendant la mise en culture.
Un système de filtration de l’air est activé avant et pendant la manipulation. On utilise des filtres à particules qui bloquent les particules supérieures à 0,22 micron. La filtration est assurée par un ventilateur extracteur qui maintient une ventilation constante, de faible vitesse à travers le filtre et qui a la particularité de produire un flux d’air stérile laminaire.
En complément du système de filtration, il est nécessaire d’effectuer un nettoyage de la paillasse à l’aide d’alcool à 90%.
Milieux de culture
Choix du milieu de culture
Une plante entière puise dans le sol les éléments qui participent à l’élaboration de ses tissus et contribuent à ses activités physiologiques. Elle a aussi la capacité de synthétiser certaines substances intervenant dans des réactions spécifiques à son organisme végétal.
En milieu artificiel on essaie de créer un milieu dont la composition offre à l’explant la possibilité de croitre et de se développer comme une plante entière.
Le choix d’un milieu de culture est difficiles car chaque espèce a son exigence propre vis-à-vis du milieu nutritif. Il faut pratiquer plusieurs essais pour trouver la solution nutritive adéquate.
La stérilisation du milieu a été réalisée par autoclavage à 121˚C pendant 25 min. Le pH a été ajusté à 5,7 – 5,8
Voici quelque milieu qui peuvent être utilisé :
- Un milieu basal (BM) contenant du TDZ pour la production de structures similaires à des protocormes (PLS).
- Un milieu MS à % de force (Murashige et Skoog, 1962) supplémenté avec NAA et BAP 1.0 mgl-1
- Un milieu de Hoagland et Arnon enrichi de 25% d’eau de coco
Une fois les graines germé elle peuvent être transférées sur des milieu plus solide comme de même composition pour une meilleur croissance
Préparation de la solution de culture
Le pesage de chaque composant d’un milieu de culture nécessite une grande précision et prend donc beaucoup de temps.
Une fois la solution nutritive préparée, son pH doit être ajusté entre 5,5 et 6. La solution doit être limpide, avec une dissolution complète de la gélose et des cristaux de sucre.
On procède ensuite à la répartition de la solution dans les récipients de culture choisis. Cette opération est assez délicate car elle implique de répartir manuellement la solution de culture à haute température dans les différents récipients.
Cette manipulation doit être effectuée rapidement pour éviter que la solution ne gélifie dans la casserole ou le ballon. Il est nécessaire d’agiter constamment le mélange pour obtenir une solution homogène dans tous les récipients. Enfin, on referme les récipients avec du coton ou un couvercle pour les boîtes spéciales de micropropagation.
Mise en culture des graines de vanille
Pour initier le processus, une hygiène rigoureuse est primordiale. Cela implique le lavage minutieux des mains et des avant-bras, ainsi que la désinfection de la paillasse de travail à l’aide d’alcool. Les instruments sont ensuite nettoyés et, si nécessaire, stérilisés à la flamme avant d’être laissés à refroidir. Les organes stérilisés de vanille sont transférés dans un récipient approprié.
La gousse est délicatement incisée à l’aide d’un scalpel, permettant l’extraction soigneuse des graines internes.
Puis elles sont immergées dans une solution de toluène pendant une durée de cinq minutes. Une agitation est effectuée pour déloger les substances adhésives présentes sur les graines.
Par la suite, un rinçage de deux minutes dans de l’alcool est réalisé pour éliminer le toluène résiduel, suivi de deux rinçages successifs dans de l’eau afin d’éliminer l’alcool.
Les graines sont ensuite immergées dans une solution d’eau de Javel, soit pure, soit diluée à 25% ou 50%. Sous l’effet alcalin et oxydant de l’eau de Javel, les téguments des graines sont attaqués.
Cette étape est cruciale car elle active la germination en rendant les graines perméables. Le processus de décapage peut durer d’un quart d’heure à plusieurs heures (jusqu’à 30 heures), en fonction de l’état des graines. Le décapage est interrompu lorsque l’examen à la loupe binoculaire révèle que les graines ont perdu presque toute leur pigmentation.
Ces dernières sont ensuite déposées directement dans un récipient contenant un milieu de gélose, préparé en amont selon les protocoles appropriés. Les graines sont ensuite cultivées dans l’obscurité à une température de 32°C. La germination des graines de vanille est un processus long et complexe.
Mise en culture des protocormes de vanille
Une fois que les protocormes ont bien évolué et recouvrent complètement la gélose, ils sont trop serrés et un repiquage doit être pratiqué.
Le transfert des protocormes du milieu de culture vers leur nouveau milieu dans le tube de culture nécessite beaucoup de soin et d’habileté pour éviter l’introduction de germes de micro-organismes dans le milieu.
Il s’agit de transvaser, à l’aide d’une pince longue ou d’une spatule, les plantules d’une boîte à l’autre.
Le tube de culture doit être incliné pour éviter la chute de poussière dans le milieu. On saisit à l’aide d’une pince à branches souples un fragment et on le plante verticalement dans la gélose de manière qu’il soit enfoncé de quelques millimètres dans le substrat. Enfin, on referme le récipient.
Il faut repiquer les plantules tous les deux mois
Installation en chambre de culture
Les boîtes contenant nos jeunes plantules sont ensuite installées dans une pièce maintenue à une température de 25°C ± 1. L’éclairage est assuré par une photopériode de 14 à 16 heures grâce à l’utilisation de lampes fluorescentes émettant une lumière blanche froide, avec une intensité lumineuse variant entre 1000 et 2000 lux.
Acclimatation en milieu naturel
Les plantules sont délicatement retirées des récipients, qui ne contiennent plus qu’un ou deux spécimens chacun. Elles sont ensuite transplantées dans des pots contenant un compost spécifique. Ce compost peut être composé des éléments suivant : coïr de coco haché, sphaigne, laine de roche, perlite , écorce de pins. L’ensemble est soigneusement mélangé et stérilisé à la chaleur humide pendant deux heures à température d’ébullition.
Les pots sont ensuite placés dans des serres ombragées mais non chauffées. Les variations de température y sont atténuées (facteur de possible pourriture de la liane) , et surtout, les plants sont protégés des fortes pluies, du vent et des prédateurs. Les plants sont régulièrement arrosés, tuteurés, bouclés, et les surfaces des pots sont périodiquement nettoyées. Après une à deux années, les plants sont transplantés en pleine terre.
