La culture in vitro est une technique essentielle en production végétale, en particulier pour les espèces qui se multiplient de manière végétative. Elle permet de produire en grande quantité des jeunes plants sains et de garantir la circulation de matériel végétal exempt de maladies.
Le microbouturage
Le microbouturage est une méthode de propagation végétative employée en botanique.
Cette technique implique le prélèvement de petites sections d’une plante parente, qui sont ensuite cultivées dans un environnement contrôlé pour générer de nouvelles plantes.
Cette approche est particulièrement bénéfique pour les espèces qui présentent des défis en matière de reproduction naturelle, comme les orchidées ou certaines plantes tropicales.
Elle permet de surmonter les obstacles associés à la pollinisation ou à la germination des graines.
En plus de faciliter la reproduction d’espèces rares, le microbouturage offre l’avantage de produire des plantes qui sont génétiquement identiques à la plante parente, assurant ainsi une uniformité au sein des populations cultivées.
Asepsie
L’asepsie est une méthode préventive qui consiste à empêcher la contamination d’une zone ou d’une surface par des micro-organismes étrangers (bactéries, parasites, etc.). Le terme aseptique désigne l’absence de tout agent infectieux. L’asepsie est le fait d’avoir débarrassé un milieu quel qu’il soit de tous les microbes qui pouvaient l’infecter. Cela peut être réalisé en utilisant des méthodes visant l’absence de contamination microbiologique d’un site opératoire par exemple. En termes scientifiques, l’asepsie peut être considérée comme une mesure de contrôle des infections qui vise à prévenir la transmission de micro-organismes pathogènes et à maintenir un environnement stérile. Elle peut être obtenue par des moyens physiques, chimiques ou biologiques, tels que la stérilisation, la désinfection et l’utilisation de barrières protectrices.
La stérilisation
La stérilisation est une procédure qui vise à éliminer tous les germes microbiens, par exemple dans une préparation. La technique de stérilisation a été mise en œuvre en portant cette préparation à une température élevée, c’est-à-dire de 100 à 180 °C. Cette méthode a été inventée par Nicolas Appert à la fin du XVIIIe siècle et est connue sous le nom d’appertisation.
Dans le domaine de la microbiologie, la stérilisation est un processus utilisé pour éliminer les micro-organismes vivants des matériaux ou des objets, y compris ceux qui sont en phase de repos, comme les spores par exemple. Le matériau devient alors stérile.
Il existe plusieurs types de traitements pour la stérilisation : les traitements thermiques, qui utilisent la chaleur sèche ou la vapeur d’eau (autoclavage), et les traitements dits « basse température ». Ces derniers peuvent comprendre le traitement chimique, souvent avec l’oxyde d’éthylène, ou le traitement par des rayonnements UV ou ionisants. Ce dernier implique l’exposition à un rayonnement gamma, généralement émis par du cobalt-60 de synthèse, ou à un faisceau d’électrons accélérés.
Un cal
C’est une structure de prolifération cellulaire qui peut être obtenue en culture in vitro en ajoutant des hormones végétales. Les cals peuvent également apparaître naturellement lors du bouturage de certaines espèces. L’obtention de cals est intéressante pour la production de plants multipliés végétativement. Pour ce faire, après avoir dispersé les cellules, on déclenche l’embryogenèse en utilisant un jeu d’hormones végétales sur le cal obtenu. Une fois les embryons bien formés, on les stabilise et on leur fournit un enrobage nutritif et une protection appropriée.
Avantages de la culture in vitro
La prolifération rapide des génotypes d’intérêt : régénération de nouvelles plantes génétiquement identiques à partir d’un explant initial
- L’accélération des cycles de développement
- La préservation ex-situ, à moyen terme des espèces en danger (dans des conditions de croissance ralentie)
- Le rajeunissement d’un matériel végétal
- Une méthode efficace pour le processus d’échange de ressources génétiques
Les inconvénients de la culture in vitro
- Des malformations dues à un déséquilibre hormonal (la vitrification).
- La production répétée de grands nombres de plants uniformes (clones) peut entraîner la perte de certains gènes nécessaires, par exemple, à la résistance aux nouvelles maladies; il est donc nécessaire de conserver le pied mère et, à certains moments, de recourir à la reproduction sexuée.
- Les clones peuvent manquer de flexibilité d’adaptation dans des milieux naturels par rapport aux populations génétiquement hétérogènes.
- La diversité génétique peut être perdue.
- Des mutations spontanées peuvent survenir
Les bases de la culture in vitro.
La culture in vitro repose sur la totipotence cellulaire des végétaux, une caractéristique unique à ces organismes. Certaines cellules végétales différenciées peuvent redevenir indifférenciées et, dans des conditions appropriées, régénérer une nouvelle plante identique à la plante mère.
La technique consiste donc à placer des organes de plantes, parfois très petits, dans des conditions artificielles et contrôlées pour reproduire plus rapidement ou en plus grande quantité des plantes entières. La culture in vitro de végétaux, également appelée micropropagation ou microbouturage, s’est généralisée à la fin des années 1960.
La culture in vitro se déroule généralement en trois phases pour le microbouturage.
La première phase consiste à introduire du matériel sain in vitro, c’est-à-dire exempt de bactéries ou de champignons de surface. En effet, la quantité de sucre apportée à la plante dans le milieu de culture in vitro pour se développer est également suffisante pour permettre aux champignons et aux bactéries de se multiplier encore plus rapidement que le végétal ! Il est donc essentiel de désinfecter tout le matériel utilisé, y compris les fragments de plantes, et de travailler dans des conditions stériles.
Le matériel de départ peut provenir de différentes parties de la plante et doit être désinfecté avec une solution de chlore actif (eau de Javel, alcool isopropylique à 70% ou hypochlorite de calcium) puis soigneusement rincé à l’eau stérile.
Pour le microbouturage, on utilise généralement un apex ou un nœud prélevé sur la tige, voire un méristème. La vitesse à laquelle l’explant redémarre dépend souvent de sa taille initiale et de l’espèce végétale.
Pour la culture de semence on utilise généralement des graines encore ou non encore dans leur testa .
Ensuite, les explants sont placés dans une salle de culture contrôlée avec une température et une durée du jour stables (par exemple : 20-22°C, 16h de jour).
La deuxième phase est celle de la multiplication ou micropropagation par ramification le long de la tige ou bourgeonnement à la base du plant. Cette étape est généralement stimulée par un apport en cytokinines (hormone de croissance produite naturellement par les végétaux) dans le milieu de culture.
Le nombre de cycles de multiplication dépend du taux de multiplication à chaque subculture et des objectifs fixés pour la production. Une subculture in vitro dure entre 2 et 6 semaines, ce qui permet des cycles rapides.
La troisième étape de la culture in vitro est la préparation à l’acclimatation. En général, l’objectif est de produire des pousses feuillées portant un apex et des racines, stimulées par les auxines du milieu. Ces racines ne sont pas fonctionnelles une fois la plante placée dans du terreau d’acclimatation, mais elles contribuent à une bonne reprise et à la formation de nouvelles racines sur le jeune plant une fois celui-ci en terre.
Une fois enracinés, les plants peuvent être acclimatés en serre. Cela consiste à les sortir d’in vitro, les placer dans du terreau horticole et les adapter progressivement aux conditions de culture normales, plus sèches et avec une intensité lumineuse plus importante qu’en laboratoire. La phase d’acclimatation des jeunes plants prend quelques jours à quelques semaines.
Un des éléments clés des conditions contrôlées de culture in vitro est l’apport des éléments nutritifs sous forme d’un substrat synthétique de composition précise, appelé « milieu de culture ». Il comporte, outre de l’eau et des éléments minéraux nécessaires à toute plante, un gélifiant (permettant de donner une texture ferme au milieu), du sucre, des vitamines et des hormones végétales.
Ces composants permettent la croissance du tissu isolé en organe, même s’il n’est pas relié à la plante mère habituellement source d’éléments nutritifs. Le sucre apporte aux fragments de plante, parfois réduits à juste quelques cellules isolées, l’énergie nécessaire pour se multiplier et donner une nouvelle plante en conditions d’hétérotrophie. L’hétérotrophie est la nécessité pour un organisme vivant de se nourrir de constituants organiques préexistants.
Les hormones végétales permettent d’orienter le développement des tissus vers la prolifération de pousses feuillées ou la croissance de racines. En cours de culture, il faut donc faire varier les hormones végétales en fonction du type de croissance recherché : des cytokinines pour favoriser la multiplication des microboutures, puis des auxines pour favoriser l’enracinement préparatoire à l’acclimatation.
Le milieu de culture in vitro a une composition complexe et adaptée à chaque espèce végétale et à chaque stade de développement de la plante in vitro. D’une espèce à l’autre, les éléments minéraux changent afin de s’adapter aux besoins physiologiques de l’espèce.
La culture in vitro est une méthode efficace pour produire des plants sains et uniformes, mais elle nécessite des équipements spécialisés et une expertise technique. Elle permet un brassage génétique et offre aussi la possibilité de créer des hybrides par le croiser de plantes différentes. Il est important de maintenir un brassage génétique pour éviter d’avoir uniquement des vanilles identiques entre elles, ce qui pourrait faciliter la transmission de maladies entre les plantes.
Toute la difficulté de la technique consiste à mettre au point la composition optimale du milieu de culture en fonction de l’objectif fixé au départ.
